Caractérisation de la voie de signalisation AMPK/ACC dans le foie et l’intestin du Psammomys obesus, un modèle animal de résistance à l’insuline et de diabète de type 2

L’expansion des maladies métaboliques dans les sociétés modernes exige plus d’activités de recherche afin d’augmenter notre compréhension des mécanismes et l’identification de nouvelles cibles d’interventions cliniques. L’obésité, la résistance à l’insuline (RI) et la dyslipidémie, en particulier sont tous des facteurs de risque associés à la pathogenèse du diabète de type 2 (DT2) et des maladies cardiovasculaires. Ainsi, la dyslipidémie postprandiale, notamment la surproduction des lipoprotéines hépatiques et intestinales, contribue d’une façon significative à l’hypertriglycéridémie. Quoique plusieurs études cliniques et fondamentales chez l’homme et les modèles animaux aient mis en évidence les rôles importants joués par le foie et l’intestin dans la dyslipidémie, les mécanismes moléculaires en cause ne sont pas bien élucidés. L’une des voies principales régulant le métabolisme lipidique est la voie de la protéine kinase AMPK. L’épuisement de l’ATP intracellulaire entraîne une activation de l’AMPK qui va œuvrer pour rétablir l’équilibre énergétique en stimulant des voies génératrices d’ATP et en inhibant des voies anaboliques consommatrices d’ATP. Les effets positifs de l’activation de l’AMPK comprennent l’augmentation de la sensibilité à l’insuline dans les tissus périphériques, la réduction de l’hyperglycémie et la réduction de la lipogenèse, d’où son importance dans les interventions cliniques pour la correction des dérangements métaboliques. Il est à souligner que le rôle de l’AMPK dans le foie et l’intestin semble plus complexe et mal compris. Ainsi, la voie de signalisation de l’AMPK n’est pas bien élucidée dans les situations pathologiques telles que le DT2, la RI et l’obésité. Dans le présent projet, notre objectif consiste à caractériser le rôle de cette voie de signalisation dans la lipogenèse hépatique et dans le métabolisme des lipides dans l’intestin chez le Psammomys obesus, un modèle animal d’obésité, de RI et de DT2. À cette fin, 3 groupes d’animaux sont étudiés (i.e. contrôle, RI et DT2). En caractérisant la voie de signalisation de l’AMPK/ACC dans le foie, nous avons constaté une augmentation de l’expression génique des enzymes clés de la lipogenèse (ACC, FAS, SCD-1 et mGPAT) et des facteurs de transcription (ChREBP, SREBP-1) qui modulent leur niveau d’expression. Nos analyses détaillées ont révélé, par la suite, une nette augmentation de l’expression de l’isoforme cytosolique de l’ACC, ACC1 (impliqué dans la lipogenèse de novo) concomitante avec une invariabilité de l’expression de l’isoforme mitochondrial ACC2 (impliqué dans la régulation négative de la β-oxydation). En dépit d’un état adaptatif caractérisé par une expression protéique et une phosphorylation (activation) élevées de l’AMPKα, l’activité de la kinase qui phosphoryle et inhibe l’ACC reste très élevée chez les animaux RI et DT2. Au niveau de l’intestin grêle des animaux RI et DT2, nous avons démontré que l’augmentation de la lipogenèse intestinale est principalement associée avec une diminution de la voie de signalisation de l’AMPK (i.e. expression protéique et phosphorylation/activation réduites des deux isoformes AMPKα1 et AMPKα2). La principale conséquence de la diminution de l’activité AMPK est la réduction de la phosphorylation de l’ACC. Étant donné que le niveau d’expression totale d’ACC reste inchangé, nos résultats suggèrent donc une augmentation de l’activité des deux isoformes ACC1 et ACC2. En parallèle, nous avons observé une réduction de l’expression protéique et génique de la CPT1 [enzyme clé de la β-oxydation des acides gras (AG)]. L’ensemble de ces résultats suggère une inhibition de l’oxydation des AG concomitante avec une stimulation de la lipogenèse de novo. Enfin, nous avons démontré que l’intestin grêle est un organe sensible à l’action de l’insuline et que le développement de la résistance à l’insuline pourrait altérer les deux voies de signalisation (i.e. Akt/GSK3 et p38MAPK) essentielles dans plusieurs processus métaboliques. En conclusion, nos résultats indiquent que l’augmentation de la lipogenèse qui contribue pour une grande partie à la dyslipidémie dans la résistance à l’insuline et le diabète serait due, en partie, à des défauts de signalisation par l’AMPK. Nos observations illustrent donc le rôle crucial du système AMPK au niveau hépatique et intestinal, ce qui valide l’approche thérapeutique consistant à activer l’AMPK pour traiter les maladies métaboliques.Understanding the cellular mechanisms involved in the development of insulin resistance, and later on the occurrence of type 2 diabetes and its metabolic complications, is a perquisite step toward the identification of new therapeutic targets to fight against the development of these metabolic diseases. In the present studies, we used the gerbil Psammomys obesus, a well-established animal model of obesity, insulin resistance (IR) and type 2 diabetes (T2D), to characterize the hepatic and intestinal signaling abnormalities associated with lipid metabolism disorders during the pathogenesis of IR and T2D. Thus, we are able to demonstrate that the development of these metabolic diseases in Psammomys obesus animals, is accompanied by increased hepatic and intestinal lipogenesis with very high efficiency to form triglycerides rich-lipoproteins. In the liver, we observed an increase in mRNA levels of key lipogenic enzymes (ACC, FAS, SCD-1 and mGPAT) and transcription factors (SREBP-1, ChREBP), which modulate the expression level of lipogenic enzymes. Thereafter, our detailed analysis of the AMPK/ACC signaling pathway revealed a rise in the gene expression of the cytosolic ACC1 isoform of ACC(involved in de novo lipogenesis) concomitant with a constant expression of the mitochondrial ACC2 (negative regulator of β-oxidation). In spite of an adaptive state characterized by higher protein expression and phosphorylation (activation) of AMPKα, the kinase that phosphorylates and inhibits ACC, the activity of the later remains very high in IR and T2D animals. In the small intestine of IR and T2D animals, we demonstrated that the increase in intestinal lipogenesis is mainly associated with a decrease of AMPK signaling pathway (i.e. reduced expression and protein phosphorylation/activation of the two AMPKα1 and AMPKα2 isoforms). The main consequence of the decline in AMPK activity is the reduction of ACC phosphorylation. Given that, the expression levels of ACC remain unchanged; our results thus suggest an increased activity of both ACC isoforms, ACC1 and ACC2. Next, we observed a reduction in protein and gene expression of CPT1 [key enzyme in fatty acid (FA) β-oxidation]. Taken together, these results suggest an inhibition of FA β-oxidation concomitant with a stimulation of de novo lipogenesis. Finally, we demonstrated that the small intestine is an insulin sensitive organ and that the development of IR affects two signaling pathways (i.e. Akt/GSK3 and p38MAPK) essentials for several metabolic processes. In conclusion, our results indicate that increased lipogenesis, in IR and T2D, which exacerbate the dyslipidemia associated with these diseases, might be, at least partially, a result of AMPK signaling defects. In addition, our observations illustrate the crucial role of AMPK/ACC in the liver and intestine and validate AMPK as a potential target to treat the metabolic diseases

Identification of novel regulatory mechanisms for for Cdc42 GTPase-activating protein CdGAP/ARHGAP31, a protein involved in development and cancer

Abstract The small Rho GTPase proteins act as molecular switches that regulate diverse cellular processes linked mostly to the actin-cytoskeleton remodeling making them essential regulators of cell adhesion, migration and invasion. Dysregulation of their activities can result in different abnormal phenotypes particularly, tumor progression and metastasis. Hence, regulators of Rho GTPases such as Rho guanine nucleotide exchange factors (RhoGEFs) and Rho GTPase-activating proteins (RhoGAPs), are critical for normal cellular responses and are targets for subversion during oncogenic transformation. CdGAP (Cdc42 GTPase-activating protein) is a member of a well-conserved subfamily of RhoGAP proteins and a negative regulator of the small Rho GTPases, Rac1 and Cdc42. Associated with a rare developmental disorder (AOS, Adams-Oliver Syndrome) and required for a normal angiogenesis, CdGAP plays important roles in the regulation of cell migration and proliferation during early development. In addition, recent findings characterize CdGAP as an essential synergistic component between TGFβ and HER2/Neu/ErbB-2 signaling pathways which play a positive role in cancer, particularly breast cancer. CdGAP is regulated by lipid binding, protein-protein interactions and phosphorylation, still these mechanisms are not well understood. In this work we first investigate the interaction between CdGAP and its negative regulator, the endocytic protein Intersectin. Using an in vitro approach, we identify a novel, atypical xKx(K/R) (SKSKK) motif in the basic rich (BR) region of CdGAP that directly interacts with the Intersectin-SH3D domain. Moreover, the well-conserved motif is required for the regulation of CdGAP activity following Intersectin binding. Next, we investigate CdGAP phosphorylation and identify two regulatory phospho-serines in the C-terminal (CT) tail, Ser-1093 and Ser-1163, that are phosphorylated by the AGC-kinase family member, RSK1. Finally, we show that 14-3-3 family members bind and regulate both the cellular localization and activity of CdGAP in a Ser-1093 and Ser-1163 phosphorylation-dependent manner. Overall, this work provides two novel CdGAP-regulatory mechanisms that can be applied in therapeutic approaches targeting this RhoGAP, particularly in breast cancers.RésuméLes petites protéines G de la famille Rho sont des commutateurs moléculaires qui contrôlent divers procédés cellulaires associés notamment, à la régulation du cytosquelette et jouent par conséquent, un rôle clé dans la régulation de la motilité cellulaire. La dérégulation de leur activité peut entrainer des aberrations se manifestant en particulier, par une progression du cancer et des métastases. Ainsi, les protéines régulatrices comme les facteurs d'échange de nucléotide (RhoGEFs) et les protéines activatrices des Rho GTPases (RhoGAPs) sont essentielles pour une signalisation cellulaire normale et sont en général, affectées lors des transformations oncogéniques. CdGAP (Cdc42-GTPase activating protein) est un membre d'une sous-famille de protéines RhoGAPs bien conservée qui régule négativement les Rho GTPases Cdc42 et Rac1. Associé à un trouble du développement rare, le syndrome d'Adams-Oliver ou AOS et nécessaire pour une angiogenèse normale, CdGAP joue un rôle important dans la régulation de la migration et la prolifération cellulaires au cours du développement. Récemment, CdGAP est identifié comme une composante synergique essentielle entre les voies de signalisation de TGFβ et HER2/Neu/ErbB-2 et qui joue un rôle proto-oncogénique, en particulier dans le cancer du sein. CdGAP est régulée par des mécanismes incluant les lipides, les interactions protéine-protéine et la phosphorylation, néanmoins, ces mécanismes ne sont pas bien élucidés. Dans cette étude, nous étudions en premier l'interaction entre CdGAP et son régulateur négatif, la protéine endocytique, Intersectin. En utilisant une approche in vitro, nous identifions un nouveau motif atypique, xKx (K/R) (SKSKK) dans la région riche en résidus basiques (BR) de CdGAP interagissant directement avec le domaine SH3D d'Intersectin. Le motif est en outre, bien conservé est requis pour la régulation de l'activité CdGAP par Intersectin. Par la suite, nous identifions deux sites de phosphorylation clés dans la région C-terminale de CdGAP, Ser-1093 et Ser-1163 qui sont phosphorylés par la protéine AGC-kinase, RSK1. Nous démontrons finalement, que les protéines adaptatrices 14-3-3 lient et régulent la localisation cellulaire et l'activité de CdGAP d'une manière dépendante de la phosphorylation des résidus, Ser-1093 et Ser-1163. La présente étude identifie deux nouveaux mécanismes de régulation de CdGAP qui peuvent être exploités dans des approches thérapeutiques ciblant cette protéine, notamment dans les cancers du sein

New Sequencing technologies help revealing unexpected mutations in Autosomal Dominant Hypercholesterolemia

International audienceAutosomal dominant hypercholesterolemia (ADH) is characterized by elevated LDL-C levels leading to coronary heart disease. Four genes are implicated in ADH: LDLR, APOB, PCSK9 and APOE. Our aim was to identify new mutations in known genes, or in new genes implicated in ADH. Thirteen French families with ADH were recruited and studied by exome sequencing after exclusion, in their probands, of mutations in the LDLR, PCSK9 and APOE genes and fragments of exons 26 and 29 of APOB gene. We identified in one family a p.Arg50Gln mutation in the APOB gene, which occurs in a region not usually associated with ADH. Segregation and in-silico analysis suggested that this mutation is disease causing in the family. We identified in another family with the p.Ala3396Thr mutation of APOB, one patient with a severe phenotype carrying also a mutation in PCSK9: p.Arg96Cys. This is the first compound heterozygote reported with a mutation in APOB and PCSK9. Functional studies proved that the p.Arg96Cys mutation leads to increased LDL receptor degradation. This work shows that Next-Generation Sequencing (exome, genome or targeted sequencing) are powerful tools to find new mutations and identify compound heterozygotes, which will lead to better diagnosis and treatment of ADH